呕吐毒素免疫亲和柱

使用对象

呕吐毒素免疫亲和柱能够特异性的纯化与浓缩样品中的呕吐毒素。呕吐毒素免疫亲和柱广泛地应用于粮食、食品、饲料、酒类、酱油、醋、酱及酱制品等样品的提取，该方法速度快、操作简单、准确性高，对准确灵敏的测定样品中的呕吐毒素起到十分重要的作用。

呕吐毒素免疫亲和柱适用于以下标准：

GB/T 23503-2009 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定-免疫亲和层析净化高效液相色谱法

SN/T 1571-2005 进出口粮谷中呕吐毒素检测方法-液相色谱法

GB/T 30956-2014 饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 免疫亲和柱净化高效液相色谱法

GB/T 5009.111-2016 食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定

原理

    样品经提取液提取、过滤、稀释，然后通过键合有呕吐毒素特殊抗体的免疫亲和柱。此时，呕吐毒素被亲和柱中的抗体特异性的吸附，用水或缓冲液将免疫亲和柱上的杂质除去，然后用甲醇使抗体变性，从而将呕吐毒素从亲和柱上洗脱下来。之后，用HPLC或荧光计进行定量检测。

储存条件

该亲和柱保存在2-8 °C条件下，绝对不能冷冻，保质期为18个月。建议在室温（18-30°C）下使用。

实验溶液制备

• HPLC流动相，乙腈/水（1+9）：取100mL乙腈于1L容量瓶中，用纯水定容至1L，用0.22微米的尼龙筛过滤。
• HPLC流动相，甲醇/水（2+8）：取200mL甲醇于1L容量瓶中，用纯水定容至1L，用0.22微米的尼龙筛过滤。
• 标准溶液的配制：取呕吐毒素标准储备液，流动相为稀释液，配制标准品溶液。例如：取100uL标准品储备液100ug/mL于10mL容量瓶中，用流动相定容至10mL，那么，呕吐毒素标准品浓度为1.0ug/mL

    注：配制好的标准品溶液2-8℃冷藏保存有效期为24h。

• pH 7.0 PBS溶液：称取8.0g氯化钠，1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，之后用纯水稀释至1000mL。

液相色谱条件

色谱柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流动相：乙腈/水（1+9）或 甲醇/水（2+8）

流速：0.8mL/min

检测器：紫外检测器波长218nm

进样体积：20~100uL

 

分析步骤

• 样品提取及稀释：
• 粮食、粮食制品、饲料样品：

 称取25g磨细的样品，5g 聚乙二醇；置于250mL具塞锥形瓶中，或匀质杯中。加入100mL纯水。以均质器高速匀质提取2min。取下盖子，将提取物到入槽纹滤纸上，滤液收集于干净的容器中。将上步提取液通过玻璃微纤维过滤器，收集滤液准备上柱净化。

酒类：

称取20g样品（含二氧化碳类酒称取前置于4℃冰箱冷藏30min，然后过滤或超声制样），置于25mL容量瓶中，加入1g聚乙二醇，用水定容至25mL，摇匀。用玻璃微纤维过滤器，收集滤液准备上柱净化。

酱油，醋，酱及酱制品：

称取25g样品，置于100mL容量瓶中，加入水定容至100mL，超声提取2min。将提取物到入槽纹滤纸上，滤液收集于干净的容器中。将上步提取液通过玻璃微纤维过滤器，收集滤液准备上柱净化。

样品的净化

粮食、粮食制品、酒类、酱油，醋，酱及酱制品：

将上步2mL滤液，以1滴/秒的流速全部通过呕吐毒素免疫亲合柱，直至空气进入到亲合柱中。用5 mL pH 7.0 PBS溶液以1-2滴/秒的流速淋洗亲合柱，再用5 mL纯水以1-2滴/秒的流速淋洗亲合柱，直至空气进入到亲合柱中。用1.0 mL HPLC级的甲醇以1 滴/秒的流速淋洗亲合柱，将1.0mL淋洗液在50℃氮气下吹干，用0.5mL流动相定容后，混匀，注入HPLC检测。

饲料：

将上步1mL滤液，以1滴/秒的流速全部通过呕吐毒素免疫亲合柱，直至空气进入到亲合柱中。用5 mL pH 7.0 PBS溶液以1-2滴/秒的流速淋洗亲合柱，再用5 mL纯水以1-2滴/秒的流速淋洗亲合柱，直至空气进入到亲合柱中。用1.0 mL HPLC级的甲醇以1 滴/秒的流速淋洗亲合柱，将1.0mL淋洗液在50℃氮气下吹干，用0.5mL流动相定容后，混匀，注入HPLC检测。

注意事项

• 样品添加回收试验时，标准品添加到样品中，静置2小时后或过夜，再进行样品前处理，否则会出现回收率偏低的现象。
• 不要随便更改操作说明书中的操作步骤，如需更改要和本公司技术部联系，确认更改是否合理。
• 操作步骤中，样品过柱，淋洗，洗脱时，一定要控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低。
• 如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准上柱液中甲醇浓度不要超过5%，否则会影响柱子的吸附能力。
• 试验中使用的玻璃仪器等，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器，否则会使检测结果偏低。
• 当用氮气浓缩洗脱液时，氮气流不要太大，否则会损失部分呕吐毒素。

 

                  需要准备的设备及试剂

物品

聚乙二醇PEG 8000

呕吐毒素标准品

泵流操作架（配有1台空气泵，6个10mL针筒）

高速匀质器，转速可达18,000 r/min ~22,000 r/min

微纤维滤纸（1.5um，100张/盒）

折叠式槽纹滤纸（100张/盒），或中速定性滤纸

一次性塑料烧杯(25/包)

一次性测试管(250支/包)

塑料漏斗(10 个/包)

色谱纯级的乙腈（4升/瓶）

色谱纯级的甲醇（4升/瓶）

C18 反相色谱柱4.6*150mm（5um）

C18 反相色谱柱4.6*250mm（5um）

玉米、饲料等基质含有不同水平呕吐毒素的质控样品