玉米赤霉烯酮免疫亲和柱

使用对象

玉米赤霉烯酮免疫亲和柱能够特异性的纯化与浓缩样品中的玉米赤霉烯酮。玉米赤霉烯酮免疫亲和柱广泛地应用于粮食、食品、饲料、坚果、花生、酱油、醋、辣椒、胡椒、药材和酒类等样品的提取，该方法速度快、操作简单、准确性高，对准确灵敏的测定样品中的玉米赤霉烯酮起到十分重要的作用。

玉米赤霉烯酮免疫亲和柱适用于以下标准：

GB/T 23504-2009 食品中玉米赤霉烯酮的测定-免疫亲和层析净化高效液相色谱法

GB/T 5009.209-2008 谷物中玉米赤霉烯酮的测定

SN/T 1172-2006 进出口粮谷中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和柱-液相色谱法

SN/T 1175-2006 进出口大豆油菜籽和食用植物油中玉米赤霉烯酮的测定

GB/T 5009.209-2016 食品安全国家标准 食品中玉米赤霉烯酮的测定

GB/T 28716-2012 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法

原理

 样品经提取液提取、过滤、稀释，然后通过键合有玉米赤霉烯酮特殊抗体的免疫亲和柱。此时，玉米赤霉烯酮被亲和柱中的抗体特异性的吸附，用水或缓冲液将免疫亲和柱上的杂质除去，然后用甲醇使抗体变性，从而将玉米赤霉烯酮从亲和柱上洗脱下来。最后，用HPLC或荧光计进行定量检测。

 

储存条件

该亲和柱保存在2-8 °C条件下，绝对不能冷冻，保质期为18个月。建议在室温（18-30°C）下使用。

实验溶液制备

• 提取液，乙腈/水（8+2）：取80mL乙腈加20mL水，混合均匀。
• 提取液，乙腈/水（9+1）：取90mL乙腈加10mL水，混合均匀。
• HPLC流动相，乙腈/水/甲醇（46+46+8）：取460mL乙腈和80mL甲醇于1L容量瓶中，用纯水定容至1L，用0.22微米的尼龙筛过滤。
• 标准溶液的配制：取玉米赤霉烯酮标准储备液，流动相为稀释液，配制标准品溶液。例如：取100uL标准品储备液10ug/mL于10mL容量瓶中，用流动相定容至10mL，那么，玉米赤霉烯酮标准品浓度为100ng/mL          

注：配制好的标准品溶液有效期为7天。  。

• pH 7.0 PBS溶液：称取8.0g氯化钠，1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。

液相色谱条件 

    色谱柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流动相：乙腈/水/甲醇（46+46+8）

流速：0.8mL/min

检测器：荧光检测器，激发波长274nm,发射波长440nm; 紫外检测器：   265nm

进样体积：20~100uL

分析步骤

• 样品提取及稀释：

谷物、粮食、花生及其制品、大豆、植物油、调料等样品： 称取40g磨细的样品，5g 氯化钠；置于250mL具塞锥形瓶中，或匀质杯中。加入100mL乙腈/水（9+1）溶液。以均质器高速匀质提取2min，或摇床震荡60min。取下盖子，将提取物到入槽纹滤纸上，滤液收集于干净的容器中。移取10 mL上步的滤液，置于干净的容器中。用40 mL纯水稀释，混匀。将上步稀释液通过玻璃微纤维过滤器，滤液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL准备上柱净化。

饲料样品：

称取40g磨细的样品，5g 氯化钠；置于250mL具塞锥形瓶中，或匀质杯中。加入100mL乙腈/水（8+2）溶液。以均质器高速匀质提取2min，或摇床震荡60min。取下盖子，将提取物到入槽纹滤纸上，滤液收集于干净的容器中。移取10 mL上步的滤液，置于干净的容器中。用40 mL pH 7.0 PBS溶液稀释，混匀。将上步稀释液通过玻璃微纤维过滤器，滤液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL准备上柱净化。

酒类：

称取20g样品（含二氧化碳类酒称取前置于4℃冰箱冷藏30min，然后过滤或超声制样），置于50mL容量瓶中，加入乙腈定容至50mL，摇匀。移取10 mL上步的溶液，置于干净的容器中。用40 mL纯水稀释，混匀。将上步稀释液通过玻璃微纤维过滤器，滤液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL准备上柱净化。

酱油，醋，酱及酱制品：

称取25g样品，置于100mL容量瓶中，加入乙腈定容至100mL，超声提取2min。将提取物到入槽纹滤纸上，滤液收集于干净的容器中。移取10 mL上步的滤液，置于干净的容器中。用40 mL纯水稀释，混匀。将上步稀释液通过玻璃微纤维过滤器，滤液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL准备上柱净化。

2） 样品的净化

将上步10 mL滤液，以1滴/秒的流速全部通过玉米赤霉烯酮免疫亲合柱，直至空气进入到亲合柱中。用10 mL纯水以1-2滴/秒的流速淋洗亲合柱2次。用1.5 mL HPLC级的甲醇以1 滴/秒的流速淋洗亲合柱，将所有样品淋洗液（1.5 mL)收集于玻璃测试管中。将1.5mL淋洗液用1.5mL纯水稀释，混匀，注入HPLC检测；或将1.5mL淋洗液在50℃氮气下吹干，用1mL流动相定容后，混匀，注入HPLC检测。        

 

         高效液相色谱仪检测玉米赤霉烯酮的标准谱图

注意事项

• 样品添加回收试验时，标准品添加到样品中，静置2小时后或过夜，再进行样品前处理，否则会出现回收率偏低的现象。
• 不要随便更改操作说明书中的操作步骤，如需更改要和本公司技术部联系，确认更改是否合理。
• 操作步骤中，样品过柱，淋洗，洗脱时，一定要控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低。
• 如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准上柱液中乙腈浓度不要超过20%，否则会影响柱子的吸附能力。
• 试验中使用的玻璃仪器等，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器，否则会使检测结果偏低。
• 当用氮气浓缩洗脱液时，氮气流不要太大，否则会损失部分玉米赤霉烯酮。

 

               需要准备的设备及试剂

物品

泵流操作架（配有1台空气泵，6个10mL针筒）

高速匀质器，转速可达18,000 r/min ~22,000 r/min

微纤维滤纸（1.5um，100张/盒）

折叠式槽纹滤纸（100张/盒），或中速定性滤纸

一次性塑料烧杯(25/包)

一次性测试管(250支/包)

塑料漏斗(10 个/包)

玉米赤霉烯酮标准品

色谱纯级的甲醇（4升/瓶）

色谱纯级的乙腈（4升/瓶）

C18 反相色谱柱4.6*150mm（5um）

C18 反相色谱柱4.6*250mm（5um）

玉米、饲料等基质含有不同水平玉米赤霉烯酮的质控样品