T-2毒素免疫亲和柱

使用对象

T-2毒素免疫亲和柱能够特异性的纯化与浓缩样品中的T-2毒素。T-2毒素免疫亲和柱广泛地应用于粮食、食品、饲料、等样品的提取，该方法速度快、操作简单、准确性高，对准确灵敏的测定样品中的T-2毒素起到十分重要的作用。

T-2毒素免疫亲和柱适用于以下标准：

GB/T 5009.118-2016 食品安全国家标准 食品中T-2毒素的测定

GB/T 23501-2009 食品中T-2毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法

GB/T 28718-2012 饲料中T-2毒素的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法

原理

 样品经提取液提取、过滤、稀释，然后通过键合有T-2毒素特殊抗体的免疫亲和柱。此时，T-2毒素被亲和柱中的抗体特异性的吸附，用水或缓冲液将免疫亲和柱上的杂质除去，然后用甲醇使抗体变性，从而将T-2毒素从亲和柱上洗脱下来。然后，用HPLC或荧光计进行定量检测。

储存条件

该亲和柱保存在2-8 °C条件下，绝对不能冷冻，保质期为18个月。建议在室温（18-30°C）下使用。

实验溶液制备

• 提取液，甲醇/水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水，混合均匀。
• 标准溶液的配制：取T-2毒素标准储备液，流动相为稀释液，配制标准品溶液。例如：取100uL标准品储备液100ug/mL于10mL容量瓶中，用流动相定容至10mL，那么，T-2 毒素标准品浓度为1.0ug/mL
• 注：配制好的标准品溶液冷藏保存有效期为7天。
• pH 7.0 PBS溶液：称取8.0g氯化钠，1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，之后用纯水稀释至1000mL。
• 4-二甲基氨基吡啶溶液: 准确称取0.0325g4-二甲基氨基吡啶于100mL容量瓶中,用甲苯定容 至刻度。
• 1-蒽腈溶液: 准确称取0.030g1-蒽腈于100mL容量瓶中,用甲苯定容至刻度

液相色谱条件

荧光法

色谱柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流动相：乙腈/水（75+25）

检测器：激发波长381nm,发射波长470nm;

进样体积：20uL

紫外法（无需衍生）

色谱柱：Agilent C18 4.6*150mm（5um）

流动相：甲醇/水（55+45）

检测器：波长208nm,

进样体积：50-100uL

分析步骤

• 样品提取及稀释：

粮食及粮食制品:

将样品研磨,硬质的粮食等用高速粉碎机磨细并通过试验筛。称取25.0g(精确到0.1g)过筛样品于均质杯中,加入提取液100mL,以均质器高速搅拌提取2min,定量滤纸过滤。 移取10.0mL滤液加入40mL水稀释混匀,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液备用。

酱油、醋、酱及酱制品：

称取25.0g(精确到0.1g)混匀的试样,用甲醇定容至50.0mL,超声提取10min,定量滤纸过滤。 移取10.0mL滤液加入40mL水稀释混匀,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液备用。

酒类：

取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类使用前先置于4℃冰箱冷藏30min,过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样20.0g(精确到0.1g)于50mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,定量滤纸 过滤。移取10.0mL滤液加入40mL水稀释,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液备用。

 2） 样品的净化

将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10.0mL上述提取滤液,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器连接,调节压力使溶液以约1滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中。用10mL水淋洗亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,直至空气进入亲和柱中,弃去全部流出 液,抽干小柱。准确加入1.0mL甲醇洗脱,流速约为1滴/s,收集洗脱液。

衍生：标准工作液和样品洗脱液各1mL,在50℃ 下用氮气吹干,加入50μL4-二 甲基氨基吡啶溶液和50μL1-蒽腈溶液,在涡旋混合器上混匀1min,50℃反应15min,在冰水中冷却10min后取出,50℃下氮气吹干,用1.0mL流动相溶解,待 HPLC测定。

注意事项

• 样品添加回收试验时，标准品添加到样品中，静置2小时后或过夜，再进行样品前处理，否则会出现回收率偏低的现象。
• 不要随便更改操作说明书中的操作步骤，如需更改要和本公司技术部联系，确认更改是否合理。
• 操作步骤中，样品过柱，淋洗，洗脱时，一定要控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低。
• 如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准上柱液中甲醇浓度不要超过25%，否则会影响柱子的吸附能力。
• 试验中使用的玻璃仪器等，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器，否则会使检测结果偏低。
• 当用氮气浓缩洗脱液时，氮气流不要太大，否则会损失部分T-2毒素。
• 衍生实验时，标准品和样品建议一起衍生，这样避免不同批次衍生之间的差异

 需要准备的设备及试剂

物品

4-二甲基氨基吡啶

1-蒽腈

泵流操作架（配有1台空气泵，6个10mL针筒）

高速匀质器，转速可达18,000 r/min ~22,000 r/min

微纤维滤纸（1.5um，100张/盒）

折叠式槽纹滤纸（100张/盒），或中速定性滤纸

一次性塑料烧杯(25/包)

一次性测试管(250支/包)

塑料漏斗(10 个/包)

T-2毒素标准品

色谱纯级的甲醇（4升/瓶）

C18 反相色谱柱4.6*150mm（5um）

C18 反相色谱柱4.6*250mm（5um）

玉米、饲料等基质含有不同水平T-2毒素的质控样品