杂色曲霉毒素免疫亲和柱

使用对象

杂色曲霉毒素免疫亲和柱能够特异性的纯化与浓缩样品中的杂色曲霉毒素。杂色曲霉毒素免疫亲和柱广泛地应用于粮食、食品、饲料、坚果、花生、酱油、醋、辣椒、胡椒、药材和酒类等样品的提取，该方法速度快、操作简单、准确性高，对准确灵敏的测定样品中的杂色曲霉毒素起到十分重要的作用。

原理

样品经提取液提取、过滤、稀释，然后通过键合有杂色曲霉毒素特殊抗体的免疫亲和柱。此时，杂色曲霉毒素被亲和柱中的抗体特异性的吸附，用水或缓冲液将免疫亲和柱上的杂质除去，然后用甲醇使抗体变性，从而将杂色曲霉毒素从亲和柱上洗脱下来。最后，用HPLC或荧光计进行定量检测。

储存条件

该亲和柱保存在2-8 °C条件下，绝对不能冷冻，保质期为18个月。建议在室温（18-30°C）下使用。

实验溶液制备

• HPLC流动相，甲醇/水（75+25）：取750mL甲醇加250mL水，混合均匀，用0.22微米的尼龙筛过滤。
• pH 7.0 PBS溶液：称取8.0g氯化钠，1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。

液相色谱条件

色谱柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流动相：甲醇-水（75+25，v/v）

流速：0.8mL/min

检测器：紫外检测器，波长325 nm

进样体积：20~100uL

 

分析步骤

方法1：样品提取及稀释：

准确称取试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠，准确加入100.0mL,80%甲醇水，以均质器高速搅拌提取2min。槽纹滤纸过滤，准确移取5mL滤液，然后用pH 7.0 PBS溶液定容至50mL，用玻璃纤维滤纸过滤，取滤液10 mL，备用。

 方法2：样品提取及稀释：

准确称取试样40.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及准确加入100.0mL乙腈，以均质器高速搅拌提取2min。槽纹滤纸过滤，准确移取20.0mL滤液，50℃氮气吹干仪下氮吹，吹干后，加入1mL甲醇溶解沉淀物，然后用pH 7.0 PBS溶液定容至20mL，用玻璃纤维滤纸过滤，取滤液10 mL，备用。

 

样品的净化   

   将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

注意事项

• 样品添加回收试验时，标准品添加到样品中，静置2小时后或过夜，再进行样品前处理，否则会出现回收率偏低的现象。
• 不要随便更改操作说明书中的操作步骤，如需更改要和本公司技术部联系，确认更改是否合理。
• 操作步骤中，样品过柱，淋洗，洗脱时，一定要控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低。
• 如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准上柱液中甲醇浓度不要超过15%，否则会影响柱子的吸附能力。
• 试验中使用的玻璃仪器等，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器，否则会使检测结果偏低。

  需要准备的设备及试剂

物品

泵流操作架（配有1台空气泵，6个10mL针筒）

高速匀质器，转速可达18,000 r/min ~22,000 r/min

微纤维滤纸（1.5um，100张/盒）

折叠式槽纹滤纸（100张/盒），或中速定性滤纸

一次性塑料烧杯(25/包)

一次性测试管(250支/包)

塑料漏斗(10 个/包)

杂色曲霉毒素标准品

色谱纯级的甲醇（4升/瓶）

色谱纯级的乙腈4升/瓶）

C18 反相色谱柱4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）