赭曲霉毒素A免疫亲和柱

使用对象

赭曲霉毒素A免疫亲和柱能够特异性的纯化与浓缩样品中的赭曲霉毒素A。赭曲霉毒素A免疫亲和柱广泛地应用于粮食、饲料、大豆、油菜籽、植物油、酱油、醋、酱及酱制品和酒类等样品的提取，该方法速度快、操作简单、准确性高，对准确灵敏的测定样品中的赭曲霉毒素A起到十分重要的作用。

赭曲霉毒素A免疫亲和柱适用于以下标准：

GB/T 23502-2009 食品中玉赭曲霉毒素A的测定-免疫亲和层析净化高效液相色谱法

SN/T 1746-2006 进出口大豆、油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素A的检测方法

GB/T 5009.96-2016 食品安全国家标准 食品中赭曲霉毒素A的测定

GB/T 30957-2014 饲料中赭曲霉毒素A的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法

原理

样品经提取液提取、过滤、稀释，然后通过键合有赭曲霉毒素A特殊抗体的免疫亲和柱。此时，赭曲霉毒素A被亲和柱中的抗体特异性的吸附，用水或缓冲液将免疫亲和柱上的杂质除去，然后用甲醇使抗体变性，从而将赭曲霉毒素A从亲和柱上洗脱下来。最后，用HPLC或荧光计进行定量检测。

储存条件

该亲和柱保存在2-8 °C条件下，绝对不能冷冻，保质期为18个月。建议在室温（18-30°C）下使用。

实验溶液制备

• 提取液1，甲醇/水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水，混合均匀。
• 提取液2，称取150g氯化钠，20g碳酸氢钠溶于900mL水中，用水定容至1L
• HPLC流动相，乙腈/水/乙酸（99+99+2）：取495mL乙腈和10mL乙酸于1L容量瓶中，用纯水定容至1L，用0.22微米的尼龙筛过滤
• 标准溶液的配制：取赭曲霉毒素A标准储备液，流动相为稀释液，配制标准品溶液。例如：取100uL标准品储备液10ug/mL于10mL容量瓶中，用流动相定容至10mL，那么，赭曲霉毒素A标准品浓度为100ng/mL              

  注：配制好的标准品溶液有效期为7天

• pH 7.0 PBS溶液：称取8.0g氯化钠，1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。
• 冲洗液：称取25g氯化钠，5g碳酸氢钠溶于900mL水中，用水定容至1L
• 真菌毒素清洗缓冲液：称取25g氯化钠，5g碳酸氢钠溶于900mL水中，加入0.1mL吐温-20，用水定容至1L

 

液相色谱条件

色谱柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流动相：乙腈/水/乙酸（99+99+2）

流速：0.8mL/min

检测器：荧光检测器，激发波长333nm,发射波长477nm

进样体积：20~100uL

 

分析步骤

• 样品提取及稀释：

谷物、粮食、大豆、油菜籽、植物油等样品：

称取20g磨细的样品，5g 氯化钠；置于250mL具塞锥形瓶中，或匀质杯中。加入100mL甲醇/水（8+2）溶液。以均质器高速匀质提取2min。取下盖子，将提取物到入槽纹滤纸上，滤液收集于干净的容器中。移取10 mL上步的滤液，置于干净的容器中。用40 mL纯水稀释，混匀。将上步稀释液通过玻璃微纤维过滤器，滤液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL准备上柱净化。

饲料,辣椒样品：

称取25g磨细的样品，5g 氯化钠；置于250mL具塞锥形瓶中，或匀质杯中。加入100mL甲醇/水（8+2）溶液。以均质器高速匀质提取2min。取下盖子，将提取物到入槽纹滤纸上，滤液收集于干净的容器中。移取5 mL上步的滤液，置于干净的容器中。用45 mL pH 7.0 PBS溶液稀释，混匀。将上步稀释液通过玻璃微纤维过滤器，滤液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL准备上柱净化。

酒类：

称取20g样品（含二氧化碳类酒称取前置于4℃冰箱冷藏30min，然后过滤或超声制样），置于25mL容量瓶中，加入提取液2定容至25mL，摇匀。移取10 mL上步的溶液，置于干净的容器中。用40 mL纯水稀释，混匀。将上步稀释液通过玻璃微纤维过滤器，滤液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL准备上柱净化。

酱油，醋，酱及酱制品：

称取25g样品，置于50mL容量瓶中，加入甲醇/水（8+2）定容至50mL，超声提取2min。将提取物到入槽纹滤纸上，滤液收集于干净的容器中。移取10 mL上步的滤液，置于干净的容器中。用40 mL纯水稀释，混匀。将上步稀释液通过玻璃微纤维过滤器，滤液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL准备上柱净化.

 

• 样品的净化

谷物、粮食、大豆、油菜籽、植物油、饲料、辣椒、酱油，醋，酱及酱制品等样品：

将上步10 mL滤液，以1滴/秒的流速全部通过赭曲霉毒素A免疫亲合柱，直至空气进入到亲合柱中。用10 mL真菌毒素清洗液以1-2滴/秒的流速淋洗亲合柱；再用10mL纯水以1-2滴/秒的流速淋洗亲合柱，直至空气进入到亲合柱中。用1.5 mL HPLC级的甲醇以1 滴/秒的流速淋洗亲合柱，将所有样品淋洗液（1.5 mL)收集于玻璃测试管中。将1.5mL淋洗液用1.5mL纯水稀释，混匀，注入HPLC检测；或将1.5mL淋洗液在50℃氮气下吹干，用1mL流动相定容后，混匀，注入HPLC检测。

酒类：

将上步10 mL滤液，以1滴/秒的流速全部通过赭曲霉毒素A免疫亲合柱，直至空气进入到亲合柱中。用10 mL冲洗液以1-2滴/秒的流速淋洗亲合柱；再用10mL纯水以1-2滴/秒的流速淋洗亲合柱，直至空气进入到亲合柱中。用1.5 mL HPLC级的甲醇以1 滴/秒的流速淋洗亲合柱，将所有样品淋洗液（1.5 mL)收集于玻璃测试管中。将1.5mL淋洗液用1.5mL纯水稀释，混匀，注入HPLC检测；或将1.5mL淋洗液在50℃氮气下吹干，用1mL流动相定容后，混匀，注入HPLC检测。

注意事项

• 亲和柱净化后的洗脱液不能用尼龙膜或有机系膜过滤，负责会损失部分赭曲霉毒素。
• 样品添加回收试验时，标准品添加到样品中，静置2小时后或过夜，再进行样品前处理，否则会出现回收率偏低的现象。
• 不要随便更改操作说明书中的操作步骤，如需更改要和本公司技术部联系，确认更改是否合理。
• 操作步骤中，样品过柱，淋洗，洗脱时，一定要控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低。
• 如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准上柱液中甲醇浓度不要超过25%，否则会影响柱子的吸附能力。
• 试验中使用的玻璃仪器等，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器，否则会使检测结果偏低。
• 当用氮气浓缩洗脱液时，氮气流不要太大，否则会损失部分赭曲霉毒素。
• 需要准备的设备及试剂

物品

泵流操作架（配有1台空气泵，6个10mL针筒）

高速匀质器，转速可达18,000 r/min ~22,000 r/min

微纤维滤纸（1.5um，100张/盒）

折叠式槽纹滤纸（100张/盒），或中速定性滤纸

一次性塑料烧杯(25/包)

一次性测试管(250支/包)

塑料漏斗(10 个/包)

赭曲霉毒素A标准品

色谱纯级的乙腈（4升/瓶）

色谱纯级的甲醇（4升/瓶）

C18 反相色谱柱4.6*150mm（5um）

C18 反相色谱柱4.6*250mm（5um）

玉米、饲料等基质含有不同水平赭曲霉毒素的质控样品